?

Log in

No account? Create an account
GFP и фиксация. - Добрая фея с топором

> Recent Entries
> Archive
> Friends
> Profile
> My Website

February 11th, 2014


Previous Entry Share Next Entry
09:19 am - GFP и фиксация.
(лопаясь от гордости): а вчера я на работе решила сложную техническую проблему. Всего-то экспериментов за пять в течение пары месяцев. Суть объяснять толку нет, так что проиллюстрирую словами, а для тех кто понимает цитометрию, и картинками под катом. Короче, то что в PNASе, Nature Immunology и остальных подобных журналах авторы смогли покрасить лишь через одно место и изобразить в лишь в виде жалкого подобия левой руки, я таки потрахалась, но покрасила прилично.
(голосом Боярского): Хех, щщенки!
***
И машинку вчера из ремонта отдали (а я так и не рассказала, что же с ней было). Так что я сегодня необычно, аж втройне добра. В виде жеста доброй воли и любви к человечеству могу осчастливить ее микроскопическую часть и поделиться секретом из сабжа (его я тоже решила, но случайно, параллельно с вот этим основным достижением). Короче, если у вас при попытке фиксации клеток пропадает в них GFP/YFP и вы давно уже решили, что это у всех так и иначе просто быть не может, то пишите в комменте что именно у вас GFP, почему вы хотите фиксировать клетки (для какой цели), на что еще вы их красите в этом эксперименте и вопрос "Таня, что же мне делать?". А я напишу вам личкой свой личный работающий протокол, сохраняющий таки GFP сигнал при фиксации, да, по-настоящему сохраняющий. Уникальное по своей щедрости предложение работает, ну скажем, месяц. ;)) Если вы понятия не имеете, что это все значит, но у вас есть френд-биолог/иммунолог/мол биолог и тп, пошлите ссыль ему, что ли. Может, оценит. Верю, что оценит, я ж только вчера пришла с воркшопа по цитометрии, где человек 50, услышав от лектора, что - увы, проблему GFP и фиксации так и не решили до сих пор, хором разочарованно вздохнули. Пришла, доделала свой эксперимент и - вуаля. Я-то решила. ;)
Поясняющие картинки. Вот это - (А, В) - жалкая попытка покрасить на CXCR5 (с одновременной фиксацией) в PNAS


А вот это -(А, С, F) - еще более жалкий результат окраски на CXCR5 с фиксацией в Nature Immunology


А у меня сигнал по CXCR5 сделан такой качественный, как на CD4 и СD8. Потому что я крута. Неимоверно просто. :))

(50 comments | Leave a comment)

Comments:


[User Picture]
From:sciuro
Date:February 11th, 2014 02:31 pm (UTC)
(Link)
ЖАДНО, ЖАДНО ХОЧУ!
(и про секрет CXCR5 тоже хочу, если отдашь :) чисто из профессионального любопытства, я сама никогда не сталкивалась с этой проблемой но посмотреть могу...
[User Picture]
From:sciuro
Date:February 11th, 2014 02:35 pm (UTC)
(Link)
(у меня, конечно, есть куча идей, как можно повозиться с такой дурной прокраской... но эти перцы из ПНАС либо не заморочились, либо там все хитро)
[User Picture]
From:f3
Date:February 11th, 2014 02:48 pm (UTC)
(Link)
Ты крута! Правда, наша биолог в лабе владеет только английским, я опухну пересказывать, да ещё и ошибусь в ста местах :))
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 11th, 2014 03:15 pm (UTC)
(Link)
Если вы не работаете с GFP, то не надо мучаться, пожалуй. :)
А вот если работаете, то скажи ей, is it possible to fix GFP+ cells for flow? И услышь в ответ стенания, что это невозможно чисто технически.
[User Picture]
From:lenkao
Date:February 11th, 2014 03:00 pm (UTC)
(Link)
Я давно гордилась своими френдами - какие они у меня все талантливые и замечательные.
Но ты просто гений! Горжусь втройне.
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 11th, 2014 03:16 pm (UTC)
(Link)
Гений - это все-таки для людей явно поумней.
А я технический трублешутер. Но крутой, похоже, чо. :))
From:moreless
Date:February 11th, 2014 03:32 pm (UTC)
(Link)
(заинтересованно) что, alexa488 поверх прокрашиваете?
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:34 am (UTC)
(Link)
Нет, GFP удалось родной сохранить, без усиления чем-либо вторым этапом. :)
[User Picture]
From:sliger
Date:February 11th, 2014 04:07 pm (UTC)
(Link)
Хм, а почему они (лекторы на воркшопах) такое заявляли? Известно же, что если у тебя флюоресцентный белок в цитозоле, то высока вероятность похерить все фиксацией/пермеабилизацией метанолом (этанолом) в морозильнике, иногда просто вымывает нафиг все, а остается только что-то вменяемое при локализации белка в мембране. "Необычная" фиксация трихлоруксуской обычно спасает в таких особо запущеных случаях.

Да, если ваш протокол действительно работает универсально, то стоит его коммерциализировать. Иначе, все равно, рано или поздно ваш подход чуток модифицируют и тогда опять покупать продукт у "дяди", а так вы сами имеете шанс стать буратинкой с недеревянными мозгами и шансом работать на себя :).
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:33 am (UTC)
(Link)
Да мой протокол не включает в себя ничего уникального, кроме как видоизменение протоколов на коммерческие киты для фиксации. Тут нечего коммерциализировать, совсем. :)
А фиксация нужна для FOXP3. Он внутриядерный, так что "легкие" или необычные способы фиксации, при которых есть шанс сохранить GFP, не прокатывают.
[User Picture]
From:Den Bye
Date:February 11th, 2014 04:50 pm (UTC)
(Link)

А фиксировать то зачем? CXCR-ки надобно сразу мерять
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:30 am (UTC)
(Link)
Ну не всегда то что надо в реальности совпадает с тем что надо по плану. :))
[User Picture]
From:Den Bye
Date:February 11th, 2014 04:51 pm (UTC)
(Link)
PD-1 коэкспрессия, ага :)
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:30 am (UTC)
(Link)
Ну у меня еще там Foxp3 и BCL6, оба только внутри. PD1 нормально superficial ловится.
[User Picture]
From:Den Bye
Date:February 11th, 2014 04:54 pm (UTC)
(Link)
А флоу в "глянцах" весьма часто выглядит, как shit...Ибо деды-ревьюеры, в основном, в современных методах не понимают.
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:29 am (UTC)
(Link)
Вот! Наконец-то я эту фразу вижу от кого-то еще. :)
А то ей богу, я говорю что оно shit, а на меня все смотрят косо - мол, PNAS же. Блин. И я тот же аргумент использую - мол, ну а кто красил-то, сам ОН, что ли? Нифига, технишен или студент. А потом послали на ревью тем, кто сам цитометрию в жизни ни разу не гонял.
[User Picture]
From:dok_zlo
Date:February 11th, 2014 08:08 pm (UTC)
(Link)
статью напиши.
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:27 am (UTC)
(Link)
Да нечего там, это ж просто решение технической задачки. :)
[User Picture]
From:uncle_grue
Date:February 12th, 2014 07:03 am (UTC)
(Link)
Публикуйся, бабка!
Публикуйся, любка!
Публикуйся, ты моя
Сизая голубка!

:-)
[User Picture]
From:kormikblog
Date:February 12th, 2014 09:19 am (UTC)
(Link)
10 баллов ))
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:26 am (UTC)
(Link)
Да нечего там. Просто траблшутинг. Разве что из самой окраски что-то получится. ;)
[User Picture]
From:kormikblog
Date:February 12th, 2014 09:19 am (UTC)
(Link)
Вспоминается "Женитьба Бальзаминова": "Добрая-добрая!"

Снимаю шляпу, чё.

И перед добротой - тоже.
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 11:26 am (UTC)
(Link)
Дык все равно в ЖЖ это мало кому надо ;))
[User Picture]
From:gaart
Date:February 12th, 2014 12:02 pm (UTC)
(Link)
Добрый день! Да, страстно хотела бы узнать секрет. Я крашу клетки для флуоресцентной микроскопии, клетки прикрепленные, распластанные, смешанные культуры клеток, экспрессирующих GFP и mKate2. mKate2 диффузный, GFP диффузный или сшитый с белком межклеточных адгезионных контактов Е-кадгерином.

При фиксации 3,7% параформальдегидом диффузные GFP и mKate видны хорошо, но препараты нестабильны, через пару недель флуоресценция расплывается. После пермеабилизации тритоном х-100 (0,5% 5 минут) или при фиксации метанол:ацетон 1:1 15 минут флуоресценция пропадает. Пермеабилизация принципиальна при параллельной окраске антителами (на фокальные контакты, кортактин, Е-кадгерин) или фаллоидином.

GFP красится прекрасно антителами Millipore AB3080P (кролик) и Rockland 600-301-215 (мышь) после фиксации параформальдегид +тритон. После метанол-ацетона не красится. Millipore AB16901 (курица) не красит совсем после фиксации согласно протоколу (вариация параформальдегид+тритон).

Буду очень признательна, если поделитесь ноу-хау. Очень нужна и нативная флуоресценция, и любые возможные варианты фиксации под куриные антитела.
[User Picture]
From:tanchik
Date:February 12th, 2014 01:44 pm (UTC)
(Link)
ОК, вечером напишу в личку. Только вот проблема - у меня протокол-то этот на цитометрию заточен. Может не сработать на микроскопию.

> Go to Top
LiveJournal.com